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此前，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)敲除技術(shù)只能在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)插入和刪除，精準(zhǔn)的片段插入和替換的效率一直很低，極大地限制了其在植物研究和育種上的應(yīng)用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術(shù)體系。
朱健康研究組通過嘗試，發(fā)現(xiàn)將供體片段同時(shí)進(jìn)行硫代修飾和磷酸化修飾后，能極大地增強(qiáng)CRISPR/Cas9引導(dǎo)的靶向敲入效率。研究團(tuán)隊(duì)先后在14個(gè)基因位點(diǎn)上成功靶向敲入了各類調(diào)控元件，包括翻譯增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，甚至整個(gè)啟動(dòng)子，供體片段最長達(dá)2049bp。通過對(duì)1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現(xiàn)，該方法的敲入效率可高達(dá)47.3%，平均效率為25%。如此高的敲入效率甚至可以同時(shí)在四個(gè)位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)多基因靶向敲入。
研究人員預(yù)計(jì)，該技術(shù)的建立將使靶向敲入成為一項(xiàng)和靶向敲除一樣的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，被各個(gè)植物研究和育種單位廣泛應(yīng)用。
同時(shí)，研究人員又巧妙地設(shè)計(jì)了一種片段精準(zhǔn)替換的策略，稱之為重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，但他們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，基因組上串聯(lián)重復(fù)片段間的HDR頻率非常高。他們利用這一現(xiàn)象，通過將修飾的片段靶向敲入目標(biāo)位點(diǎn)，人為制造這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)TR-HDR去實(shí)現(xiàn)片段替換。采用該技術(shù)，他們?cè)谖鍌€(gè)基因位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了片段替換和原位的Flag標(biāo)簽蛋白的精準(zhǔn)融合，效率最高達(dá)到了11.4%。這一技術(shù)突破將有助于植物學(xué)研究，并促進(jìn)農(nóng)作物定向遺傳改良的進(jìn)程。（岳陽）
中國科學(xué)報(bào)
